بررسی پلی مورفیسم کدون 72 ژن p53 در زنان مبتلا به سرطان سینه در استان آذربایجان شرقی با سیستم تکثیر متزلزل جهش ها (arms)

سرطان چیست؟ سرطان، اختلال در کنترل رشد و تمایز سلولی می باشد. تعداد زیادی از سلول های بدن در طول زندگی رفتار و عمل طبیعی دارند. با توجه به فراوانی جهش ها، انتظار اشتباهاتی در هر ژن می رود که میلیون ها بار در طی زندگی اتفاق می افتد، و لذا مکانیسم های تنظیم سلولی باید واجد روند های تصیح کننده موثر باشند. بروز سرطان پیامد علکرد سلول ها می باشد. در نتیجه سرطان می تواند به علت اختلال در کنترل رشد و تمایز و عدم ایجاد تعادل صحیح بین سلول های بدن در طی زندگی، اتفاق بیافتد. سلول های سرطانی در یک زمان، به طور غیر عادی رشد کرده و به مناطق نابجای بدن مهاجرت می کنند که نشان دهنده اختلال در عملکرد و روند سلولی می باشد ]1[. سرطان شامل بیش از 200 بیماری مختلف می باشد که در مجموع حدود یک چهارم مرگ و میر را در کشورهای صنعتی غرب به خود اختصاص می دهد. بروز و مرگ و میر اکثر سرطان ها با افزایش سن افزایش می یابند ]1[. سرطان های با منشاء اپی تلیال، کارسینوما نامیده می شود که شایع ترین نوع سرطان محسوب می شوند. این سرطان از نظر میزان بروز و مرگ ناشی از آن حائز اهمیت می باشند. از جمله آنها می توان سرطان ریه و روده بزرگ (کلون و رکتوم) در هر دو جنس (مرد و زن) و سرطان سینه در زنان و سرطان پروستات در مردان را اشاره کرد]2[. در گذشته ویروس ها و مواجهه با عوامل محیطی چون تابش های یون ساز را در بیشتر سرطان ها، دخیل می دانستند. امروز معلوم شده است که یکی از علت های بنیادی، جهش های ژنی است. هر عامل سرطان- زایی، با ایجاد جهش عمل می کند. جهش های منتهی به سرطان، بر ژنهایی تا?ثیر می گذارند که مسئول تکثیر سلولی و سایر فعالیت های بنیادی سلول است. با ایجاد تغییر، رشد کنترل نشده آغاز می شود و تومور پدید می آید ]1[. علاوه بر جهش، عامل دیگر بروز سرطان پلی مورفیسم های ژنتیکی می باشد پلی مورفیسم اشاره به وجود تفاوت آللی در یک جایگاه ژنی دارد ]3[. این پلی مورفیسم ها عامل تفاوت افراد در داشتن صفات منحصر به فرد می باشد، و عامل استعداد افراد به بیماری، فراوانی سرطان در یک جمعیت، سن بروز سرطان در یک فرد یا پاسخ به درمان سرطان ها و همچنین برهمکنش با جهش های شناخته شده مستعد کننده بیماری می باشد ]4[. هفت علامت آگاه کننده که توسط انجمن سرطان امریکا بیان شده است، عبارتند از: 1. تغییرات عادات دفع ادرار و مدفوع، سرطان پروستات، مثانه یا رکتوم را مطرح می کند. 2. زخمی که التیام نمی یابد، ممکن است نشان از سرطان پوست و دهان باشد. 3. خونریزی یا ترشح غیر معمول، می تواند از سرطان مثانه، دهانه رحم، ریه و رکتوم خبر دهد. 4. توده یا سفتی در پستان ممکن است با سرطان سینه همراه باشد. 5. سوء هاضمه یا مشکل بلع می تواند علامتی از سرطان معده، لوزالمعده، مری و حلق باشد. 6. تغییر تازه در خال یا زگیل 7. سرفه یا گرفتگی صدا، سرطان ریه و حنجره را مطرح می کند ]5[. بسیاری از دانش ما در زمینه مکانیسم های تنظیمی سلول طبیعی و نحوه ی ایجاد سلول سرطانی از مطالعه بر روی سلول های کشت شده بدست آمده است. در سال 1952 های-فیلیک مشاهده کرد که سلول های پیکری طبیعی انسان در محیط های کشت، ظرفیت تقسیم محدودی داشته در مرحله ای به پیری روی می- آورند. این نقطه را m1 می گویند ]6[. در ادامه این مرحله، درست زمانی که تصور می شود که سلول ها از بین رفته اند، تعدادی ناگهان رشد کرده و از مرحله بحرانی عبور می- کنند و تکثیر می شوند. عوامل مختلفی مانند بیان انکوژن های ویروسی یا بلوکه شدن ژنهای سرکوب گر تومور ، از جمله مهمترین آن ها p53، باعث به وجود آمدن سلول های نامیرای سرطانی می شود که با تلقیح به جانور آزمایشگاهی، ایجاد تومور می کند ]6[ . سرطان سینه شایع ترین بدخیمی کشنده در زنان جهان است ]7[، به طوریکه یک سوم از زنان سرطانی به این نوع سرطان مبتلا هستند ]8[. در هر سال بیش از 1000000 مورد جدید بیماری تشخیص داده می شود ]9[. شیوع و میزان مرگ و میر در اثر سرطان، در نژاد ها و موقعییت های جغرافیایی مختلف بسیار متفاوت است، به طوری که حداقل در آسیا به میزان 4 برابر کمتر از آمریکای شمالی می باشد ]10[. در مجموع 95% از سرطان های سینه، از بافت اپی تلیال آن منشاء می گیرد. کارسینومای سینه به دو گروه در جا و مهاجم تقسیم می شود ]11[. در نوع در جا، سلول های توموری فقط در مجاری یا لوبول ها وجود دارند و تهاجم به استرومای اطراف با میکروسکوپ نوری دیده نمی شود. نوع درجا خود به دو گروه لوبولار و مجرایی تقسیم می شود. کارسینومای غیر مهاجم مجاری سینه، شایع ترین نوع سرطان غیر مهاجم پستان می باشد که بیشتر در سال های اولیه ی یائسگی دیده می شود. در این نوع کارسینوما، مجاری پستان درگیر بوده، اما سلول های سرطانی به بافت استرومای پستان گسترش نمی یابد. در نوع مهاجم، سلول های توموری به استرومای اطراف هجوم می برند که متاستاز و به دنبال آن مرگ بیمار رخ می دهد ]12[. کارسینومای مهاجم سینه به چند زیرگروه تقسیم می شود که شایع ترین نوع آن(80-75 %)، کارسینومای مجرایی مهاجم است. این سرطان از مجاری شیری شروع شده و با گذشتن از دیواره ی مجرا، به بافت چربی پستان می رسد. در این مکان از طریق سیستم لنفاوی و عروق خونی می تواند به بخش های دیگر بدن متاستاز دهد. کارسینومای مجرایی مهاجم براساس ویژگی های ساختمانی و سیتولوژیکی به سه درجه تمایزخوب یا درجه یک، تمایز متوسط یا درجه دو و تمایز ضعیف یا درجه سه تقسیم میشود ]13[. سرطان سینه با تغییرات ژنتیکی مانند جهش در ژنهای سرطانزا (انکوژن ها) و ژن های سرکوبگر تومور مرتبط است ]7[. ژن p53 برای اولین بار در سال 1979 توسط دو دانشمند به نامهای لان و کرافورد کشف شد ]14[. ژن p53 به عنوان مهمترین ژن سرکوبگر تومور از فرضیه دو ضربه ای نادسون پیروی می کند ]15[. ژن p53 دارای 11 اگزون ]16[، به طول 20 کیلوباز و سه ناحیه عملکردی می باشد: 1- یک ناحیه اسیدی در n- ترمینال (کدون های 101-1)، که خود این ناحیه شامل دو دومین اصلی است، یکی دومین اسیدی فعال کننده رونویسی (کدون های 42-1) و دیگری دومین غنی از پرولین (کدون های 97-63) 2 - ناحیه مرکزی متصل شونده به مرکز dna (کدون های 299-102): این ناحیه یک پروموتور دارای موتیف مورد توافق را که از دو قطعه 10 جفت بازی تشکیل شده است و توسط 13-0 جفت باز از هم جدا می شوند را شناسایی می کند. این ناحیه در طی تکامل شدیدا حفاظت شده می باشد. هم چنین این ناحیه همولوگ ترین ناحیه بین خانواده های p53 از جمله p63 و p73 می باشد. 3- ناحیهc- ترمینال بازی (کدون های 393-293): این ناحیه در تترامریزاسیون و تنظیم فعالیت p53 درگیر است. این ناحیه شامل سه منطقه میشود: منطقه اول شامل سه سیگنال جا یابی هسته ای می باشد، منطقه دوم شامل دومن تترامریزاسیون بوده و منطقه سوم ناحیه تنظیم کننده ی منفی می باشد. این ناحیه ممکن است از اتصال dna به ناحیه مرکزی پروتئین p53 جلوگیری کند ]17.[ طول پروتئین کد شده توسط این ژن، 393 اسید آمینه می باشد، این پروتئین به عنوان یک پروتئین هسته ای دارای هر دو سیگنال جایابی هسته ای و خارج کننده از هسته می باشد که آن را به پروتئین شاتل تبدیل کرده است ]15[. عملکرد طبیعی این پروتئین محافظت از ژنوم در مقابل صدمات وارده و استرس های گوناگون نظیر ژنوتوکسیک ها و یا عوامل دیگری نظیر هیپوکسی (کمبود اکسیژن)، حذف نوکلئوتیدی، فعال شدن انکوژن ها و به هم خوردن نظم میکروتوبول ها می باشد ]17[. ژن p53 دارای 9 ایزوفرم می باشد ]18[، که این ایزوفرم ها حاصل استفاده از چندین پروموتر و فرایند پیرایش های متناوب این ژن، و همچنین استفاده از جایگاه های شروع ترجمه داخلی میباشد ]14[. جهش در ژن p53، شایع ترین رویداد در سرطان های انسانی می باشد ]8[، به طوری که جهش این ژن در 46-16% از سرطان های سینه دیده می شود ]19[. بیش از 90% جهش های این ژن در اگزون های 9-5 رخ می دهد که این اگزون ها کدکننده دومین متصل شونده به dna می باشند ]8[. بیشتر جهش های ژن p53 از نوع بدمعنی و تغییر قاب خواندن می باشد ]3[، به طوری که 97%از جهش های بدمعنی در توالی کدکننده دومین مرکزی رخ می دهد ]15[. علاوه بر جهش، پلی مورفیسم های p53 به عنوان عامل خطرساز برای ایجاد سرطان در نظر گرفته شده است. پلی مورفیسم ژنتیکی p53 ممکن است تعیین کننده حساسیت افراد در سرطان هایی مانند سینه، کلورکتال، ریه و نازوفارنژیال باشد ]19[. تغییرات نژادی و جغرافیایی در عملکرد پلی مورفیسم ژن tp53 دخیل است. حداقل 37 پلی مورفیسم در این ژن کشف شده است ]20[، که به طور معمول یکی از متداولترین آن در کدون 72 موجود در اگزون 4 قرار دارد ]21[. اگزون 4 اسیدآمینه های 125-33 را کد می کند ]16[. پلی مورفیسم کدون 72 کد کننده اسیدآمینه آرژنین (cgc: arg) و یا پرولین (ccc: pro) می باشد ]21[. در سال 2005، نوما و همکاران ارتباط معنی داری بین ژنوتیپ p53 و خطر ابتلاء به سرطان سینه پیدا نکردند ولی نشان دادند که بین پلی مورفیسم کدون 72 (arg/arg) ژن p53 با سرطان سینه گیرنده استروژن مثبت (er+ ) به ویژه در زنان یائسه ارتباط وجود دارد ]3[. بویرا و همکاران در سال 2003 ارتباط معنی داری بین ژنوتیپ arg/arg در کدون 72 ژن p53 و سرطان سینه در بیماران ترک گزارش کردند]23[. به طور مشابهی، لاگرد و همکاران در سال 2002 گزارش کردند که آلل arg در کدون 72 ژن p53، باعث رشد زیاد سلول های کارسینومای سینه در جمعیت نروژ می باشد ]27[. در سال 2000، پاپاداکیس و همکاران ژنوتیپ arg/arg در ژن p53 را به عنوان فاکتور خطر سرطان سینه در جمعیت مصر گزارش کردند ]28[. در مطالعات دیگری، تومیسکا و همکاران در سال 2005 هیچ ارتباط معنی داری را بین واریانت های کدون 72 ژن p53 و خطر ابتلاء به سرطان سینه مشاهده نکردند ]29[. کالمیا و همکاران در سال 2005 ارتباط معنی داری بین پلی مورفیسم arg/arg ژن p53 با سرطان سینه در جمعیت شمال مصر گزارش کردند ]7[. مطالعات صورت گرفته در ایران روی پلی مورفیسم کدون 72 ژن p53 با سرطان سینه در اصفهان ]19[ و در شمال ایران ]8[ هیچ ارتباط معنی داری را بین این پلی مورفیسم و سرطان سینه نشان نداد. مطالعات دربدن موجود زنده (in vivo) نشان می دهد که استعداد تغییرشکل وابسته به پاپیلوماویروس انسانی (hpv)، در هموزیگوت های آرژنین 7 برابر هتروزیگوت های arg/pro می باشد، زیرا انکوپروتئین e6 در hpv بیشتر تمایل دارد که پروتئین p53 دارای آلل arg/arg راغیرفعال کند تا پروتئین دارای آلل پرولین را ]30[. علاوه بر مطالعات پلی مورفیسم کدون 72 ژن p53 در سرطان سینه، ارتباط این پلی مورفیسم در سرطان های دیگر نیز بررسی شده است. در سال 2005 جین و همکاران در جمعیت هند گزارش کردند که ژتوتیپ arg/pro در کدون 72 ژن p53 نسبت به ژنوتیپ arg/arg، مرتبط با پیشرفت زودرس سرطان ریه می باشد ]31[. مطالعه دیگری در جمعیت هند در سال 2005 توسط دو دانشمند بنام های بهتاکاریا و سنگوپتا روی سرطان سرویکال وابسته به hpv نشان داد که ارتباط معنی داری بین هموزیگوت پرولین در موقعیت کدون 72 ژن p53 با این سرطان وجود دارد ]32[. کوشیک و همکاران در سال 2005 ارتباط معنی داری بین پلی مورفیسم کدون 72 (arg/arg) ژن p53 و خطرابتلاء به نئوپلازی اینترا اپی تلیال کشف کردند ]33[. با توجه به افزایش سرطان پستان در چند دهه ی اخیر، بیماری های پستان و تشخیص به موقع آنها از اهمیت ویژه ای برخوردار خواهد بود. به طوری که امروزه نیمی از زنان به خاطر بیماری پستان خود، با پزشک مشورت می کنند و حدود 25 درصد از خانم ها در نهایت تحت بیوپسی قرار می گیرند. هم چنین با توجه به اینکه سرطان پستان شایع ترین بدخیمی در میان زنان جهان و اولین علت مرگ زنان 44 – 40 ساله می باشد، اهمیت اقدامات تشخیصی زودرس و حتی غربالگری های دوره ای بیش از پیش روشن می شود. نکته ی مهم این است که سرطان پستان یک بیماری هتروژن می باشد و طبقه بندی های موجود، تمام انواع این بیماری را پوشش نمی دهند. از این رو نیاز به یک مارکر مولکولی قوی (مختص یک انواع بیماری) و سریع و حساس با ویژگی بالا ضروری می نماید ]22[. در ایران نیز با وجود اینکه سرطان پستان در میان زنان ایرانی رایج می باشد، مطالعات اپیدمیولوژی کمی در مورد فاکتورهای خطر این بیماری در ایران انجام گرفته است. با توجه به اینکه، تفاوت نژادی و موقعیت جغرافیایی نقش مهمی را در خطر ابتلاء به سرطان سینه دارد ]3[، و با توجه به مطالعه ی انجام گرفته توسط بویرا و همکاران که ارتباط معنی داری بین پلی مورفیسم arg/arg ژن p53 با سرطان سینه در زنان ترک پیدا کردند ]23[ و از آنجا که بین آنها و زنان آذربایجان از نظر نژادی ارتباط نزدیکی وجود دارد و همچنین به علت عدم بررسی ارتباط این پلی مورفیسم با خطر ابتلا به سرطان سینه در زنان استان آذربایجان شرقی، ما بر آن شدیم در این تحقیق به مطالعه ی پلی مورفیسم کدون 72 (arg/arg) ژن p53 به عنوان مارکر احتمالی جهت استعداد ابتلاء به سرطان سینه، با سیستم تکثیر متزلزل جهش ها (arms)، بپردازیم. در این تحقیق با استفاده از این تکنیک سه گروه هموزیگوت (arg/arg)، (pro/pro) و هتروزیگوت (arg/pro) بر روی ژل آگارز جداسازی شدند. سپس از هر گروه چند نمونه، به منظور تائید نتایج، توالی یابی شدند. همچنین اگزون 4 از لحاظ موتاسیون احتمالی، توسط تکنیک بررسی تغییرات ساختاری تک رشته ای (sscp) مورد بررسی قرار گرفت. موارد مشکوک به حضور موتاسیون با استفاده از تکنیک توالی یابی بررسی شدند.